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    Western Blot 操作步驟多，每一步的失誤都會(huì)造成全盤失敗，從試劑與設(shè)備的選擇到實(shí)驗(yàn)條件的摸索，都很關(guān)鍵。如果初學(xué)者想要做好 Western Blot，記住以下的操作技巧，或許能夠事半功倍。

   一、蛋白質(zhì)的樣品制備:

    蛋白質(zhì)在樣品處理過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。

    樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20μL 檢測(cè)蛋白質(zhì)定量用），然后 -20°或 -80℃中長(zhǎng)期保存，注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。

    切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)應(yīng)注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。

   二、蛋白質(zhì)定量：

    如果要定量的話，一般選擇 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求檢測(cè)波長(zhǎng)為 562nm，Bradford 為 595nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽性結(jié)果，建議先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考馬 G250 混合看是否產(chǎn)生顏色。

    按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般不超過 15μL，加樣孔的大限度可加 20μL 樣品。

    上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，在沸水中煮 3~5min 使蛋白充分變性。也可以使用 PCR 儀 95℃ 加熱 5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在 4℃ 冰箱短時(shí)間保存，也可在 -20℃ 冰箱保存數(shù)月，切勿反復(fù)凍融。

   三、SDS－PAGE電泳：

    未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。

    灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。加水液封時(shí)速度要很慢，否則膠會(huì)被沖變形。

    聚合時(shí)間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30min 左右，AP 不新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時(shí)膠是會(huì)凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不會(huì)超過 1h，若超過 1h 甚至更長(zhǎng)仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯(cuò)誤。推薦 APS 每周新鮮配置。

    取適當(dāng)體積樣本混合 1X SDS loading buffer（事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100℃ 加熱 5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如 45~55℃ 加熱  1h 達(dá)到變性的目的。

    加樣前可用 5mL 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。加入下一個(gè)樣品前，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。

    電泳時(shí)間和電壓說法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。

   四、轉(zhuǎn)膜：

    我們實(shí)驗(yàn)室使用的是半干轉(zhuǎn)膜電泳槽。對(duì)于轉(zhuǎn)印 90kd 以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加 SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037% 的 SDS 。

    切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1min~2min。

    在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。

    用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動(dòng)，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因?yàn)橐粋€(gè)氣泡的厚度對(duì)于蛋白來說都是十萬八千里的。

    用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會(huì)導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時(shí)轉(zhuǎn)好幾條膠的時(shí)候更要小心，有一個(gè)膠短路就會(huì)影響整體的轉(zhuǎn)移效率。

   五、免疫雜交反應(yīng)：

    如果是自己配置的封閉液，應(yīng)過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。

    一抗一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用 TBST 稀釋也可以，熟練后還可以配制一些自己的復(fù)方稀釋液，用后可回收重復(fù)用 2~3 次，但回收重復(fù)利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。

    二抗作用的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，實(shí)踐證明一抗時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)可能沒什么關(guān)系，而二抗時(shí)間若過長(zhǎng)過短都將會(huì)直接影響結(jié)果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。

    后是化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影，定影以及凝膠圖象分析的步驟，一般來說按照說明書來操作，在此不多贅述。